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细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180～200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的催化下加上FITC标记的dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜检测；同时荧光素亦可被抗荧光素抗体（anti-fluorescein antibody）标记，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈棕色），因而在普通光学显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。

• 对于细胞样本的预处理
  详见试剂盒说明书。
  
• 阳性对照及阴性对照的准备
  详见试剂盒说明书。
  
• 标记和显色反应：
  
  • 预处理好的样本PBS漂洗2次，每次5min后，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
    
  • 配制TdT酶反应液：
    

    成分	1个样品	5个样品	10个样品
    平衡液	45μL	225μL	450μL
    荧光标记液	1μL	5μL	10μL
    TdT酶	4μL	20μL	40μL
    TdT酶反应液总体积	50μL	250μL	500μL

    
    
  • 每个样本滴加50μL TdT酶反应液，加盖玻片37℃避光湿润反应60min。（阴性对照片不加TdT酶）
    
  • 把第3步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min。
    
  • 荧光显微镜下观察，可以使用的激发波长范围为450～500nm，发射波长范围为515～565nm（绿色荧光）。可进一步用DAB进行染色观察
    
  • anti-fluorescein antibody及DAB工作液的配制：
    
    • anti-fluorescein antibody工作液的配制：
      

      成分	1个样品	5个样品	10个样品
      anti-fluorescein antibody	10μL	50μL	100μL
      PBS	40μL	200μL	400μL
      Streptavidin-HRP工作液总体积	50μL	250μL	500μL

    • DAB工作液的配制：
      • 先把试剂盒中DAB粉末用PBS溶解配制成20×DAB（10mg/mL），配制方法如下：
        

        DAB	2mg	5mg	10mg
        PBS	0.2mL	0.5mL	1.0mL

      • DAB工作液的配制：

        成分	1个样品	5个样品	10个样品
        20×DAB（10mg/mL）	5μL	25μL	50μL
        30％H2O2	1μL	5μL	10μL
        PBS	94μL	470μL	940μL
        DAB工作液总体积	100μL	500μL	1000μL

  • 将第5步处理好的样本周围用滤纸或吸水纸吸干，再滴加50μL～100μL anti-fluorescein antibody工作液，加盖玻片37℃湿润避光反应30min。
    
  • 把第7步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，样本周围用滤纸或吸水纸吸干。
    
  • 将第8步处理好的样本滴加50μL～100μL DAB工作液，室温孵育5～30分钟或根据显色情况孵育适当时间。
    
  • 把第9步处理好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5min，可直接光学显微镜下观察拍照。
    
  • 选做(本步骤可不做)：用苏木素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色。随后用PBS漂洗3次，每次5min，光学显微镜下观察、拍照。